65. Kary Mullis，發明了五十年來最實用的革命性技術--PCR

[簡介: Michael Smith；H. Gobind Khorana]

Kary Banks Mullis (1944- )發明polymerase chain reaction (PCR，聚合酶鍊反應，1983)，和Michael Smith (1932-2000)[註一]共同獲得1993年Nobel Prize。

生於Lenoir (美國North Carolina州)，在Georgia Institute of Technology 以及加州大學，Berkeley，於1973年取得PhD。之後曾經在UC Berkley教過書、寫過小說，再進入Kansas大學做生化研究，又開過麵包店兩年，後來他的朋友Thomas White相勸，於1979年進入加州的Cetus Corporation of Emeryville。

在此公司，他設計出polymerase chain reaction ，可以將一個DNA在短時間內複製成無數個DNA，因而獲得諾貝爾化學獎。

PCR的原理有三個步驟: 一、將DNA加高熱，使DNA中成對的雙螺璇(double helix) denature，分裂成單鍊；二、冷卻，讓單鍊的primers “退溫”(anneal)；三、然後以促進DNA合成的酵素DNA polymerase，在高熱中，使各個單鍊再從溶液中徵招需要的 “基”(base)，形成兩對新的雙螺璇double helix (extension)。這一輪的反應持續地重複，DNA會複製，成為四個、八個、十六個、、、，幾何級數地增加。數小時內就可以有數十億的DNA被複製。

用這個方法，任何樣品中只要有一隻細菌或一個細胞的DNA，不論是活的或是死的，都可以大量複製，到可以檢驗DNA序列(sequence)，認出是甚麼微生物，或是誰的DNA。因此PCR可用於診斷出細菌或病毒等感染病原、檢查遺傳性疾病、法醫學偵查罪犯、檢查親屬關係、研究人類演化等等，其用處無數，對現代生活各方面有革命性的影響。[按:診斷感染症，檢查出病原是非常地重要，確認病原就可以對菌下藥。因此懷疑有感染的病人，都要做身體各種體液的細菌培養，包括血液、痰、尿、傷口、膿，甚至有必要的話，胸腔液、腦脊髓液、腹膜液、糞便等等。有細菌，就可以做藥敏試驗，選用適當的抗生素。不過一般感染症病患，能夠培養出細菌的不到一半，而被培養出來的細菌也不一定就是病原。培養出來的細菌很可能就是病原的，只約三分之一；如果已經開始抗生素治療時，血液中就算是有細菌，培養出細菌的機率很低 (對大部分感染病患，要如何選用適當的抗生素，是要靠仔細的病史詢問、以及醫師的學識及經驗)。腦脊髓液、胸腔液、腹膜液內的結核菌數目少，用培養的方法很難做診斷；這時候PCR的用處極大。不過PCR的費用目前還很貴，不能例行地使用。PCR認出來的細菌，也無法做藥敏試驗。]

但是這個發明是否Mullis一人的功勞，卻有一番爭議。他的自傳裡說，在1983年和他的女朋友開車到他週末休息處，途中他突然想到這個方法。其實PCR的原理在1971年有一位挪威學者Kjell Kleppe和1968年的Nobel Laureate， H. Gobind Khorana [註二]合寫一篇二十頁長的論文，刊登在Journal of Molecular Biology。且早在1969年六月十八日，Kleppe就在New Hampshire的Gordon Conference演講，並使用兩個primers及DNA polymerase示範DNA的 “repair replication”，將一個DNA片段複製成為四個。當時在場聽講的有Stuart Linn教授，Linn回去自己的課堂後，用Kleppe的材料重複實驗給學生看，這學生當中就有Kary Mullis! (可能Mullis吸收了這個觀念，埋入腦筋潛意識內，幾年後這個想法再出現在他腦筋中，以為全部是他自己想出來的。這是常有的現象，也不能說是欺騙或誤導)。

這個PCR的困難處，是在需要選用耐熱的DNA polymerase。原來使用E. coli的polymerase (酵素，是蛋白質，一般蛋白質在加熱時會被破壞)促進DNA雙螺旋(double helix)分裂成單鍊或聚合時，需要加熱，加熱時這個酵素蛋白會很快被破壞，因此每一個cycle都要加新的DNA polymerase進去，費時費工。1986年Mullis想到使用耐熱的Taq polymerase就不必要每個cycle填加一次酵素，他再使用輪迴 "加熱-冷卻" 的機器，thermal cycling。有此進展，PCR才得以成為可以自動化、實用的快速檢驗法。

Taq polymerase是Thomas Brock於1965年從靠近火山口高熱溫泉中生長的細菌Thermus aquaticus分離出來的，簡稱Taq Pol或Taq。它能在75-80°C保存其活性，在97.5°C 時有九分鐘的半生期；而可將DNA的1000個base pair在72°C中不需要十秒鐘就能複製。

Taq的一個缺點就是複製時會發生錯誤，每九千個nucleotides就有一個錯。現在的DNA polymerase是使用從一種單細胞生物、不靠太陽的光和熱、在沸點溫度可以生存、沒有細胞核或細胞內小器官的 "第三類生物" (archaeon) Pyrococcus furiosus分離出來的Pfu DNA polymerase，用這個酵素就幾乎沒有複製的錯誤(high fidelity amplification)。這細菌在70 °C (158 °F) 及103 °C (217 °F)間的溫度都可以生長，最適當的生長溫度是100 °C (212 °F)，pH則是5到 9 (optimum pH 7)。

不過，是否Mullis自己想出Taq也有Cetus公司的人提出異議。有一本書寫道，1983年Mullis提出PCR的想法時，他的同事們都無法了解其重要性，似乎只有Mullis是 "先知"。但1983年Mullis提出PCR的觀念，Cetus就讓Mullis專門做這方面的工作。Cetus也讓Randall Saiki及Henry Erlich加入PCR計畫，設法做出HIV及其他利用PCR的工作。Saiki在數月之內寫出第一篇報告，而Mullis還在寫他的描寫PCR的文章，顯然公司反應很快。

考古學家Paul Rabinow對「科學的發現」有興趣，於1966年出書寫PCR方法的歷史，質疑Mullis是否發明了這個方法。他不認為科學的發現是一個人、一個天才的產品。他寫，PCR的發展就是典型的團隊的工作(teamwork)! [http://www.worldlingo.com/ma/enwiki/en/Kary_Mullis] [按: 一個新的構想，idea，其實很多是其他人的想法，一滴一點，經歷多年累積成型的]。

1986年他離開Cetus，成為San Diego的Xytronyx, Inc.的分子生物學主任。1987開始當多家公司的顧問。(Angenics、Cytometrics、Eastman Kodak及Abbott Labs)。

PCR的研發後Cetus於1991年將其專利權賣給Hoffman-La Roche，價格是三億美元!!  Mullis研發PCR之後得到的獎金只有一萬美元!。後來DuPont公司要和Roche競爭買下專利失敗，提起訴訟，說Khorana於1971年就有此構想，Cetus並不能聲稱擁有專利。Mullis雖已離開Cetus，但替它辯護(其實也是替自己辯護)，Khorana則不願出庭作證，因此1991年DuPont敗訴。

除了PCR，Mullis還發明了照射紫外線就會變色的塑膠；發明從血液中十五分鐘之內透析出DNA的方法(本來需要一整天)。1992年他建立一個公司，想要賣附有名人(如Elvis Presley、Marilyn Monroe等人)DNA之裝飾品! 1994年，他在California Monthly也承認製造過、使用過很多種迷幻藥，amphetamine、LSD等，說當時加州的人很多都在用，是mind-opening experience，幫助他想出PCR的方法!

在得到諾貝爾獎之後，他開始講一些不是他專業份內的意見: 不認為AIDS是由HIV引起；不認為太空中ozone layer(臭氧層)減少，地球氣溫逐漸增高；又說他相信占星術、心靈感應等。都是反科學的怪想法，而受到很多批評。

他結婚三次，有兩個前妻生的孩子。喜歡surfing (衝浪)。

[註一: Michael Smith，1932-2000，英國裔加拿大生化學家。從1961年開始在Univ. of British Columbia研究，到去世。研究DNA，研發一種方法 (site-directed mutagenesis)，可以重組基因碼，可以將蛋白質內的特定氨基酸置換。他的研究可以導致癌細胞抗體的研發，以及改造出生長快速的穀物。因此他和Kary Mullis共享1993年諾貝爾化學獎]。

[註二: H. Gobind Khorana，1922- ，Har Gobind Khorana，或 Hargobind Khorana，印度裔美國生化學家，研究核酸內的nucleotide如何控制蛋白質的合成，而和Marshall W. Nirenberg、Robert W. Holley共同獲得1968年Nobel Prize。同年他歸化成美國公民]