18. Louis Pasteur--確立 "細菌會致病"

[史上有名微生物學者的傳記，按其生年排列，可以成為有趣的感染症學發展史。其中＃18. Louis Pasteur是最著名的幾位之ㄧ]

Louis Pasteur (1822-1895) :生於法國小鎮Dôle皮革工人之家[左下圖]，據說小時不甚特出，只喜歡釣魚，但是老師有眼光，建議送去巴黎求學。可是十五歲的小孩，還要由爸爸過來接回去，在Arbois以及 Besançon的學院學習文書(Letter)及數學[顯然小孩時期不容易看出將來的可能成就! 老師的能力非常重要！] ，1840年畢業，再進入巴黎名校école Normale Supérieure of Paris。他第一次的入學考試十四名，他不接受，再考一次是第三名，才入學。他學習結晶學 (crystallography)。

畢業後他任物理學教授，研究tartarate(酒石酸鹽)及paratartarate的結晶折光，在顯微鏡下他發現化學合成的結晶結構，有右向或左向(dextro-rotatory, levo-rotatory) 對掌性的的兩種。他用尖細的刀，在顯微鏡下將對稱的結晶分開[可看出他的好奇心很強哦！]，赫然發現方向不同的 結晶分別會有右向折光或左向折光的現象；自然界的結晶兩種混合存在，因此看不出會折光。他是第一個發現結晶有optical isomers(同分異構性)現象的人，這是他26歲的事。

他的發現經法國科學院polarized light的專家Jackues Biot確認，Biot還告知他Mitscherlich的研究 [Law of isomorphism是由德國化學家Eilhard Mitscherlich (1794 – 1863)；於1819年就提出]，Pasteur也立即成名。1852年他擔任Strasbourg大學化學系教授，31歲時成為在工業區新建的Lille大學科學院院長。

不久，他被製醋業者請求，研究醋有時會發酵(fermentation)失敗而腐敗的現象。他使用顯微鏡，發現發酵是因為酵母菌yeast引起，如果有其他細菌就會使發酵失敗。此時他發覺酵母菌及細菌在水、空氣中，無處不存在。糖份發酵時一定需要酵母菌。當時有些化學家還以為酵母菌是「自然產生」（spontaneous generation）的 [空氣中有生命力，使生物「自然產生」的觀念持續了兩千多年，1860年法國政府懸賞給解決這個問題的學者]。他就做一個實驗(1862年，swan neck flask experiment)，用一玻璃瓶裝雞肉汁，瓶口是狹窄長型向側面彎曲呈天鵝頸狀的管子。將瓶內肉汁加熱滅菌後，一直都不會長菌。用這種swan neck flask的實驗和Spallanzani的實驗不同處[＃10. Lazzaro Spallanzani (1729-1799)；做實驗，證明加熱後瓶口密封的肉汁不會腐敗。又做第一個體外授精，人工授精]，就是Pasteur的瓶口是開的，空氣沒有被抽出成半真空、也沒有被密封，顯示，就算空氣中有所謂的 “vital force”(生命力)也不能使細菌產生。因為長的瓶口彎曲，所以空氣中的細菌都在彎曲處沾在瓶頸處。此後主張「自然產生」的人完全消失。他建立了「外來的細菌會致病」的germ theory基礎。也贏得法國政府1860年懸賞的獎金。

以後他到巴黎école Normale Supérieure，也到Sorbonne工作。當時他還沒有實驗室，要自己設法，查看他的細菌培養結果，還得彎腰進入小空間!    1863年拿破崙三世要求他研究為何製酒時會發酸。多次實驗結果，他發現攝氏55度加溫半小時，可以消滅酒中的細菌，又不會影響啤酒或葡萄酒的味道。他於1864年發表低溫殺菌的方法，稱為pasteurization [要感謝法國軍隊喝酒的慣例，才發現了這個現代最普遍使用的殺菌法!!]。此方法並不能完全殺死細菌，但喝下這種牛奶還是不會生病。他和好友，也是醫界偉人Claude Bernard[註一]常會討論，Bernard認為疾病是體內的細菌引起的，維持身體的內部平衡(homeostasis)才重要，細菌不重要!

Pasteurization只能殺死大部分細菌，並不能完全滅菌，但不會影響牛奶、酒類品質。現在牛奶的pasteurization有high temperature/short time (HTST，用71.7 °C =161 °F ，15–20 秒)及ultra-high temperature (UHT，135 °C =275 °F ，一瞬間)。如果是extended shelf life (ESL)，就是用比HTST更低溫，加細菌過濾法。普通寫pasteurized，是指的HTST，要冷藏才能維持十天到十六天之久。他發現低溫殺菌法後曾申請專利，但很快就放棄，以便使這方法廣泛地被世人所使用。

[註一: Claude Bernard:1813 – 1878，法國的生理學家，主張科學實驗要用 “blind experiment”: 做實驗的工作者不能知道被實驗的人誰是實驗組、誰是對照組，以免受bias=成見的影響，致使結果不客觀。他原來對文學有興趣，後來改攻醫學，發現: 胰臟的消化功能；肝臟的製糖過程glycogenesis；控制血管擴張收縮的交感神經系統；又發現身體會維持homeostasis(希臘文stand still之意)，他認為germ不重要，體內平常就有細菌，身體內部的平衡(milieu intérieur, internal balance)，好的營養，去除毒素才是避免疾病的方法；以後由哈佛大學的Walter B. Cannon(1871-1945；1914-1919任美國生理學會會長)在1932年寫一本 “The wisdom of the body” 使homeostasis一字通俗化。

Cannon以血糖、體溫、及acid-base balance為例，說明身體有“organized self government”，會自動地將這些身體狀態維持一定的正常水準]。 Claude Bernard尤其對科學研究方法的議論具有權威性。死時空前地被公祭。哈佛的醫學歷史教授Bernard Cohen(1914 - 2003)譽為最偉大的科學家之ㄧ。在Bernard 1865年發表的An Introduction to the Study of Experimental Medicine(“醫學實驗的探討”)，他對怎樣的科學理論才是好的、誰才是重要的科學家、真正的發明者，很精確地描繪其特性]。

Bernard用以下的對照說明:

u        Known and unknown(已知與未知): 偉大的科學家是會研究、照亮「未知」，使科學向前進步。

u        Authority vs Observation(權威者的學理和自己的觀察): 不論有多偉大的學者支持過去的學問學理，如果你眼前的實驗觀察結果和它相反，你應該接受你自己的觀察，丟棄學理。

u        Induction and Deduction(歸納與演繹推論): 歸納是由一事推廣到整體的公理；推論是從整體的理論推演到一事，兩者無法分離。學理要用實驗測試，以辨真假，這些實驗可能導致新的學理。

u        Cause and Effect(因與果): 科學家要決定因果關係。其目的就是要從自然界的現象找出其原因。我門要設定假說，再去證實。

u        Verification and Disproof(證實與反駁): 學理是假說，需要多數事實去證實；雖然已經有事實，還是不能絕對地相信。發現了「現象」的「原因」之後，還要看「原因」沒有了，「現象」是否還會發生。我們隨時要設法否定我們自己的學理；要設法做相反的實驗(counter-experiment)。如果自己的理論被否定，我們得接受事實。

u        Determinism and Average (絕對性與平均值): 在醫學，因果關係必定是要絕對性的。一般用數學在生物學中，用的是平均值。用平均值，不一定能夠救生命(95%有效的治療法，還是有5%的病人治療無效!)。雖然用數學表達是科學的目的，醫學仍然有很多未知，我們目前還得先做定量的分析，然後再定性。

u        Truth vs Falsification(真實與作假): 不斷的尋求未知是科學的本質，實驗要能夠反應自然界的現象。偉大的學者不會自我滿足，繼續求知實驗。他還列舉科學家典範Joseph Priestly [1733-1804，發現oxygen=氧氣，為了維護phlogiston theory=燃氣學說，結果他被科學界排斥隔離] 及Blaise Pascal [1623-1662，法國數學家、物理學家、發明家、作者、天主教義哲學家，除了眾多發明，還寫過「科學的方法」，也主張「真空」的存在，和維護源自Aristotle的主流意見相反。39時死亡]。Bernard 還批評腦筋死板的人只會批評別人的錯誤，不願面對自己的誤謬。這些人只會做出假的實驗結果。

u        Discovering vs Despising(發現與鄙視): 鄙視同夥之研究員者缺乏科學家應有的求知精神。他們不會使科學進步。真正追求「真實」的科學家，如果只發現的是一片段知識，也將是「真實的全部環節」中很重要的一部份]。

 

Pasteur在做這方面的研究時，發現厭氧菌(anaerobic bacteria)，有些細菌可以無空氣、氧氣也可以生存(anaerobiosis)。酵母菌在無氧氣時，可以將糖份轉化為酒精；有足夠氧氣時糖分就直接成為二氧化碳及水分。他的發現引起很大的爭議，到他死後兩年，才有人從酵母菌分離出酵素，可以使糖份發酵，顯然酵母菌可以在無氧氣時製造這種酵素。[好奇心強，又不顧別人異樣的眼光，肯深入調查，就會有很多新發現！]

1865年他被請求解決法國蠶絲業，蠶絲生病死亡(病名Pébrine，由寄生蟲microsporidium引起)的問題。他拿顯微鏡到法國南部，四個月後分離出致病菌，再過三年，想出解決辦法，救回法國蠶絲業。

他的細菌會致病的觀念，促使他在1870-1871年Franco-Prussian war(法德戰爭)時，硬要求軍方用蒸氣消毒紗布，用殺菌劑消毒器材。結果傷口感染遽然減少，1973年他雖然不是醫師，被接納為法國Academy of Medicine之ㄧ員。[知道是對的，就要堅持！]

至此，他發表的文章有Studies on Wine (1866), Studies on Vinegar (1868), Studies on the Diseases of Silkworms (1870), and Studies on Beer (1876)。1774年他得到英國Copley Medal [Royal Society of London由Sir Godfrey Copley設立，1731年開始，給最優秀科學家的獎章，又有獎金五千英鎊] "For his researches on fermentation and on pebrine"[給獎時都應該清楚地説明理由!]。

 

1876-1877年間牛羊畜牧業發生炭疽病(anthrax)大流行，細菌當時已經被Robert Koch及其他人分離出來。他先用極度稀釋法，呈現極度稀釋的溶液還是會引起疾病，表示溶液內的毒素不是致病原因，持續分裂繁殖的細菌才是感染致病的病原。1881年他將細菌輕度加熱，發現可以減低細菌毒性，他用這減毒細菌做為疫苗，注射給羊群，用對照組證明減毒的細菌可以預防炭疽病。這是Jenner用牛痘後，第一次用人工減低毒性的(attenuated)細菌製造的疫苗，Pasteur用Jenner使用的vaccination名詞，稱為vaccine。

狂犬病是歷史非常古老的疾病。在BC 3000年的Indo-Aryan宗教紀錄Saskrit就有。"rabhas"之意就是"to do violence"(施暴力)。希臘文相當於rabies一字為，"lyssa"源自字根"lud"，意即"violent"(激烈的)。因此屬於這一類病毒都屬於 lissa。公元前23世紀在巴比倫法典就有記載古代期就知道此病和動物(尤其狗)的關係。到十六世紀Girolamo Fracastoro [排名＃7；(AD 1478 – 1553)；敎傳染病學De Contagione；第一位發現梅毒流行，命名syphilis] 描述疾病及其傳染途徑。到Pasteur製造出疫苗，才減輕對此疾病的恐怖畏懼心。

狂犬病是病毒引起的，無法用細菌培養方法分離。Pasteur他們努力了五年，到1884年，他想出繁殖病毒的方法。他冒險從發病的狂犬口中吸出其唾液，感染兔子，再取出兔子的神經組織，在無菌空氣中室溫乾燥，就可減低狂犬病毒毒性。他用這減毒的狂犬病毒當疫苗(attenuated vaccine)，經主治醫師的同意(因為他自己不是醫師)，1885年注射在一個被狂犬咬傷十四處的九歲孩子，Joseph Meister，注射十二天，結果這孩子沒有發生狂犬病，其實有這種狂犬抓咬的病人不一定都會發病，不過全世界讚揚他的成就。世界「狂犬病日」(Rabies Day)九月二十八日，是為了要引起世人注意而在2007年設立的。

 

他1849年一月在Strasbourg時見到大學校長之女兒Marie Laurent，數週內就求婚，五月結婚。生有五個孩子。Marie還會幫忙工作聽寫筆記信件。他雖然有很多重要成就，也有過不少的爭議。1888年他用世界各地的捐款建立Pasteur Institute [左圖]，到現在還是世界免疫學、細菌學教學研究的重鎮。

他父親於1865年去世，1866年兩個女兒因為傷寒死亡，1868年他中風，身體左側麻痺，他還是繼續工作了二十年，更令人起敬。他所受到的榮譽無數。1895年他獲得了荷蘭十年才一次的Leeuwenhoek Medal (Nobel Prize是1901年開始的)，他死亡時法國國葬，遺體葬在Pasteur Institute。他生前的生活狀況被神秘化，私人筆記到1971年才公開。1895年 九月二十八日 死亡前的一句話: "One must work. I have done what I could."。

 

據說以後還有一個故事，1940年德國軍佔據巴黎，一德國軍官要求看Pasteur的墓，有一老守墓員硬是不肯開門，當這軍官堅持時，這位守墓員就寧可自殺殉職，他的名字叫做Joseph Meister，就是五十五年前第一位接受狂犬疫苗的九歲孩子。

 

註二: 有關狂犬病 Rabies之醫學知識簡介如下:

狂犬病是人畜共通疾病(zoonosis)。幾乎所有哺乳類動物都可以為宿主。被帶有狂犬病病毒之動物咬傷或舐舔，傷口感染就可能致病。全球性疾病，但台灣、日本、英國、愛爾蘭、挪威、瑞典、葡萄牙、澳洲、紐西蘭、新幾內亞、太平洋島嶼、西印度及大西洋群島之一部份，目前動物群中無病例。潛伏期3- 8週，或可長達1-2年。具感染力時期是動物發病前3~7天至整個發病期。

病變狗在發病後5~7天死亡。有前驅期(病狗性情改變，微燒、畏光、瞳孔擴張等)；狂躁期(3天後病狗變更興奮、流口水、躲在暗處)；痲痺期(病犬喉部肌肉痲痺無法進食，最後陷入昏迷而死亡)。

人發病時也會有焦慮、頭痛、發燒、咬傷部位異樣感，接著出現痲痺、飲水時吞嚥困難(hydrophobia)，且併有精神錯亂及抽搐現象，最後因呼吸痲痺而致死。

診斷：由接觸病史和臨床表現來診斷。發病72小時內由鼻咽分泌物做病毒培養，(要2~6天)。也可由動物之腦部或頸背髮跟部之皮膚切片做螢光染色或病毒培養。

防治：寵物應定期注射動物用狂犬病疫苗。勿走私動物。被溫血動物咬傷應立即洗滌並消毒傷口。並將咬傷人之動物留觀十天，如果動物沒發病，人就不會感染此病。台灣沒有狂犬病，但中國是疫區。

被患有狂犬病動物咬傷之患者，應於48小時內注射一劑人用狂犬病免疫球蛋白，以中和傷口病毒。並注射五劑人用狂犬病疫苗：第一劑在疑似狂犬病動物咬傷後立即注射，其餘在第一劑注射後之第3、7、14和30天時施打。(需至衛生署防疫處或檢疫總所憑診斷書和處方箋領取)。

 

註三: 有關炭疽桿菌的醫學知識: Bacillus anthracis （炭疽桿菌）

歐洲古代期就由羅馬詩人Virgil描述炭疽病。1877年Koch分離純的細菌，之後建立著名的「Koch基本條件」。土壤中的孢子可在噬草動物及人類致病(anthrax﹑炭疽病)(“Anthrax”=希臘文 “黑炭”)。可以藉動物皮毛﹑羊毛﹑皮革﹑肉類傳染人類，動物可經飼料被感染。主要有皮膚﹑肺臟﹑及消化道三種部位的感染。致命率高、有疫苗可以預防﹐因此可做為生物戰之工具。病患需要強制隔離。Bacillus anthracis有有毒的及無毒的兩種。

孢子進入皮下﹑呼吸道﹑或消化道後生長，產生毒素。儲主是牛、羊、馬、豬等草食動物。孢子可在土壤、動物皮毛中長達數十年，可經吸入、吞食、傷口接觸等途徑；叮人的蒼蠅也可傳染。潛伏期從數小時到七天。動物者可長達兩週。美國自2001年10月有恐怖份子寄出有炭疽孢子的信件，以致有二十餘名受到感染，六名死亡。

病變：有皮膚炭疽(1-3公分直徑無痛之潰瘍，中央成黑色焦痂如「炭」。附近水腫； 然後可能入血液、腦。95%之炭疽病屬此。約20%會死亡；有治療時1%。另一型是呼吸道炭疽(一般上呼吸道症狀後好轉；6-8天後惡化，24小時內死亡。治療後仍會因毒素致命)。還有消化道炭疽(難診斷。死亡率25-75%)。

診斷﹕靠病史、用普通的細菌培養(15-24小時內長出)、水泡液抹片、或血清抗體等檢查。Ascoli test為1911年就發展出的檢驗血液中細菌抗原的方法。如果動物被懷疑死於anthrax，抽血做檢查後將動物焚化、不做屍體解剖，以防細菌因意外擴散。

治療：用penicillin、ciprofloxacin、或用erythromycin﹑tetracycline或doxycycline﹑chloramphenicol、ciprofloxacin、streptomycin亦可。要注意消毒環境。

預防：用多劑疫苗；有活性疫苗，或用外毒素成份製成的非活性疫苗(92.5%有效)。 有飛沫接觸時，除了疫苗，給予預防性doxycycline或ciprofloxacin 30天。動物如不用疫苗時，給藥60天。